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全能核酸酶 Omnipotent Nuclease(同benzonase)

Q:贴壁细胞如何处理

A:贴壁细胞去除培养基,用PBS洗后,100µL RIPA裂解液(或其他哺乳动物细胞裂解液)中加入1~5µL全能核酸酶,室温孵育30min,收集裂解液,离心取上清即可进行下游实验。


Q:悬浮细胞如何处理

A:悬浮细胞离心收集后,在离心管中加入100µL RIPA裂解液(或其他哺乳动物细胞裂解液)加1~5µL全能核酸酶,室温孵育30min,收集裂解液,离心取上清即可进行下游实验。


Q:组织样品如何处理

A:将30~100mg动物或植物组织研磨充分后,加入100~200µL裂解液,同时加入1~5µL全能核酸酶,室温孵育30min,收集裂解液,离心取上清即可进行下游实验。


Q:大肠杆菌或其他细菌如何处理

A:细菌离心收集后,用裂解液或者研磨破碎后,每100µL加入1~5µL全能核酸酶,室温孵育30min,收集裂解液,离心取上清即可进行下游实验。


Q:如何稀释

A:正常建议稀释比例(终浓度)为1:1000~1:20000,其中时间、温度、稀释比例为影响反应的正面因素。


Q:是否用PBS稀释

A:是的


Q:能否减少用量

A:如希望减少用量,可酌情提高反应温度或延长时间


Q:反应辅助因子

A:反应液中必须补加2-5mM Mg2+


Q:反应缓冲液

A:常用生物缓冲液,如TBS、MOPS(pH6-8)等


Q:反应抑制因子

A:在含有以下物质,Omnipotent  Nuclease的活性会降低50%或以上:
                  >150mM 一价阳离子,    >100mM 磷酸盐
                  >100mM 硫酸铵,        >100mM 盐酸胍
                  >0.1%SDS,             >1%Triton X-100
                  >1%Tween 20


Q:稀释后每次用多少量,如何试梯度?起始加多少?

A:看不同的实验要求,添加量可以按照1/100-1/10000之间。真核细胞需要量比原核细胞量高,因为真核细胞中核酸含量高真核细胞起始添加量可以按照1/1000的比例添加,原核细胞可以按照1/10000的比例添加;4℃消化DNA添加量比室温消化DNA添加比例高,因为室温下Omnipotent  Nuclease酶活力更高。普通CoIP实验,蛋白质表达实验可以适当稍加,对DNA残留要求高的实验,可以按照1/100的比例添加。


Q:怎样灭活Omnipotent  Nuclease核酸酶?如何去除?

A:采用EDTA螯合金属离子会可逆地抑制Omnipotent  Nuclease核酸酶活性,极端条件会造成不可逆失活,例如:100mM NaOH,70℃处理30min等。Omnipotent  Nuclease核酸酶可采用阴离子交换柱或气相色谱法从目的产物中分离出去,由于这种核酸内切酶及其稳定,建议在终产物要求排除核酸酶的应用中不要使用Omnipotent  Nuclease核酸酶。


Q:储存条件

A:保存于-20℃。储存buffer:20mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 2mM MgCl2, 50% glycerin。


Q:PH

A:建议反应体系pH值为6~8


Q:反应中需不需要加Mg2+

A:反应中Mg2+的终浓度为5~10mM


Q:Omnipotent  Nuclease纯度

A:>99%


Q:Omnipotent  Nuclease作用

A:它将核酸完全消化成3-8个碱基长度的5’-单磷酸寡核苷酸。


Q:Omnipotent  Nuclease特点

A:无蛋白酶、内毒素污染,没有标签,方便下游实验操作


Q:酶活单位定义

A:将在30min内,ΔA260降低1.0(相当于完全消化37µg DNA)定义为一个酶活单位,即1EU。


Q:Omnipotent  Nuclease应用

A:1、蛋白提取时去除核酸污染:在重组蛋白纯化或哺乳动物细胞裂解物下游要求粘度较低的情况下,可以利用Omnipotent  Nuclease核酸酶降低样品粘度以利操作;
     2、有效减少存放的外周血单细胞(PBMC)的结块现象;
     3、有利于不可溶性蛋白复性前,高质量包涵体制备;
     4、有效去除带负电荷的核酸对双向SDS-PAGE蛋白样品的影响;
     5、在非常广泛的条件下(6M urea, 0.1 M Guanidine HCl,  0.4% Triton X100, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF), 降解所有形式的(双链,单链,线状,环状)DNA和RNA;
     6、去除蛋白质产品中的污染,符合FDA关于核酸污染去除的规程;
     7、本产品可以与多种细胞细菌裂解液配合使用,去除粗提物中的核酸,降低溶液粘性,提高蛋白质产量。


Q:Omnipotent  Nuclease核酸酶与蛋白酶抑制剂混合物是否兼容?

A:Omnipotent  Nuclease核酸酶与蛋白酶抑制剂混合物兼容,但含有EDTA的蛋白酶活性抑制剂。当EDTA浓度>1mM时,会抑制核酸酶活性,建议:如果必须加EDTA,按照2倍EDTA浓度补加Mg2+


Q:目的蛋白不溶,需要进行变性条件纯化。Omnipotent  Nuclease核酸酶能在尿素环境降解核酸吗?

A:实际上,Omnipotent  Nuclease核酸酶在具有尿素(6M)的情况下会增加活性。在尿素浓度为6M时,活性会先增加,再随着时间的延长活性降低。尿素浓度为7M时,Omnipotent  Nuclease核酸酶会在15min后出现变性并失活。但在酶失活前,多数的核酸已被降解。如果Benzonase核酸酶的原浓度较高时,会部分补偿7M尿素的影响。


Q:产品的稳定性如何,如果不小心在室温放置几天后,酶活性会受到怎样的影响?

A:室温2-3天,对活力影响不大


Q:用全能核酸酶处理表达蛋白的粗提裂解液,来去除核酸污染,但Taq酶纯化过程中避免不了少量细菌DNA的残留

A:Taq酶纯化时,除了用Omnipotent  Nuclease消化,后期还需要离子交换树脂和分子筛或者透析方法去除DNA残留


Q:反应条件

A:Omnipotent  Nuclease 核酸酶的活性需要1-2mM Mg2+.而在单价阳离子浓度>50%,磷酸浓度>20mM,硫酸铵浓度>25mM等情况下,Omnipotent  Nuclease 的活性会降低50%


Q:Omnipotent  Nuclease 核酸酶与蛋白酶抑制剂混合物可以兼容吗

A:Omnipotent  Nuclease 核酸酶与蛋白酶抑制剂混合物是可以兼容,但是对于含有EDTA配方的蛋白酶抑制剂混合物要特别小心,EDTA浓度大于1mM时会抑制Omnipotent  Nuclease 的活性。


Q:Omnipotent  Nuclease与超声的作用区别

A:超声的确可以破碎细胞或者组织,但是和Omnipotent  Nuclease有不同之处!

   1.Omnipotent  Nuclease可以将DNA和RNA消化成3-8个碱基的单磷核苷酸,而超声只能打碎为大片段,所以处理完样品很多还是很粘稠,不易吸取上样;所以在COIP实验时,加入Omnipotent  Nuclease可以降低背景。

   2.如果目的蛋白被核酸包裹,只能使用Omnipotent  Nuclease将核酸消化,才能将蛋白释放;

   3.超声就是在冰上操作,也会产热,易降解热敏感的蛋白;Omnipotent  Nuclease可以在低温下消化,不会降解目的蛋白。


Q:哪些实验可能用得到Omnipotent  Nuclease,在哪一步骤加Omnipotent  Nuclease

A:例如:his蛋白纯化,IP实验。细胞裂解时


Q:样本黏度高,不易过柱

A:细胞破碎后由于含有大量DNA和RNA,黏度很高,过柱不容易。解决的方法有两种:1是用核酸酶。2也可以用高压匀浆。都可以达到降低黏度的作用。
差别在于:用核酸酶,DNA和RNA可以绛解成小片段或单核苷酸;高压匀浆用机械剪切力将DNA和RNA处理成较大的片断。
超声波处理在处理小量表达的时候问题不大,但做大量蛋白表达的时候有困难。
   核酸酶的另外一个重要应用是:若你的目的蛋白是DNA结合蛋白,那么纯化的时候最好先用核酸酶处理。  

Q:我的目的蛋白不溶,需要进行变性条件纯化。Omnipotent  Nuclease核酸酶能在尿素环境消化核酸吗?

A:实际上Omnipotent  Nuclease核酸酶在有尿素(浓度可达6M)的情况下会增加活性。在尿素浓度为6M时活性先增加,随着时间延长活性又有降低。尿素为7M时,Omnipotent  Nuclease核酸酶15分钟后出现变性并失活。但是在酶失活前多数核酸已经降解了。如果Omnipotent  Nuclease核酸酶的原浓度较高时会部分补偿7M尿素的影响。


Q:说明书中建议100ul添加1-5ul 全能核酸酶Omnipotent  Nuclease,而最下面的tips中又建议1:1000-20000稀释,那么上一句1-5ul是指稀释前的量还是稀释后?

A:说明书上的三个例子都是从上游实验开始 就使用全能核酸酶 其核酸残留较多,所以需要用量较多
   如果从下游实验开始 其中核酸残留本身已经比较少 则需要的全能核酸酶的用量 按照1:1000--1:20000的比例添加即可------这也是一般工业级的使用方法
   科研实验的话 建议按照说明书上面的建议 进行操作 效果更佳



Q:我的样本大概是100mL菌液,推荐买多少Omnipotent  Nuclease核酸酶?

A:需要根据重悬菌体所需裂解液的体积来确定需要酶的量。若普通蛋白纯化,则需要浓度为25U/mL;核蛋白则需要100U/mL;病毒表达蛋白纯化需要浓度为12.5U/mL;疫苗产品需要量为0.9~1.1U/mL。


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